HIF-1α/BNIP3/Beclin-1信号通路介导的自噬与孕期缺氧胎鼠肾发育障碍的机制研究

【摘要】研究背景：高血压和肾疾病的发病率及死亡率日益增加，严重威胁人类健康。长期以来，认为遗传和生活方式在其发病中起重要作用。近年来，大量的流行病学研究表明宫内不良环境造成胎儿的发育程序化，导致其发生高血压和肾脏疾病的风险增加。出生体重低于2500克的婴儿均称为低出生体重（LowBirthWeight,LBW）儿，通常由早产（PretermBirth,PB）或宫内生长迟缓（IntrauterineGrowthRetardation,IUGR）所导致。据统计，LBW发生率约为7-15%。1989年DavidBarker教授首次提出心血管疾病与出生体重有关，进而发展成胚胎编程学说：低出生体重（LowBirthWeight,LBW）是心血管疾病发生的独立危险因素之一，对成年期的肾脏疾病和高血压可产生不同的影响。PB或IUGR导致的LBW伴发肾及肾单位发育不良，是日后肾疾病发生的危险因素。充足的氧供对胎儿的生长发育是必需的，缺氧会影响胎儿发育。孕期缺氧是胚胎发育中的常见现象，妊娠期母体的多种生理因素或病理因素诱发孕妇缺氧。研究表明胎儿孕期缺氧不仅会引起胎儿宫内生长受限，造成胎儿LBW，还会造成胎儿重要组织器官譬如肾的发育不良。孕期缺氧对胎儿肾发育造成怎样的病理改变，目前国内外报道甚少。大量研究显示：成熟肾脏在病理状态下高表达的分子，在肾脏发育过程中也高表达，而且细胞表型的改变类似于胚胎肾发育过程中后肾间充质细胞向上皮细胞转分化的逆过程。这些研究结果提示肾脏损伤后细胞的再生过程和肾脏胚胎发育过程有着极其密切的关系，因此，对肾发育的研究有助于理解后天性肾脏疾病发生的病理生理机制。自噬和凋亡在胚胎、器官的发育以及组织分化过程中起重要作用。自噬，又名II型细胞程序性死亡，是一个自体吞噬的过程，即：亚细胞膜结构发生动态的形态学改变，并通过溶酶体介导蛋白质和细胞器降解的过程，主要包括4个环节：底物诱导自噬前体（proautophagosome，PAS）的形成、自噬体（autophagosome）形成、自噬体与溶酶体融合和自噬体内容物被降解。LBW患者肾及肾单位发育落后的机制还不完全清楚。研究表明I型细胞程序性死亡即凋亡是LBW患者肾及肾单位发育落后的原因之一。自噬是否也参与了这一过程国内外尚未有报道。自噬激活过程，往往与凋亡共存或同时发生。一个突破性的研究表明凋亡抑制分子BCL-2可以通过与自噬的标记物之一Beclin-1相互作用，进而对自噬发挥作用。自噬在孕期缺氧大鼠肾单位发育的作用及其机制目前国内外都未见报道。因此，进一步论证自噬与肾单位发育的关系，深入分析其分子调控机制就显得十分必要。PI3K/Akt/mTOR和HIF-1α/BNIP3/Beclin-1是细胞低氧条件下发生自噬上调的二条重要信号通路。本课题对此二条信号通路是否参与了孕期缺氧诱导的肾发育障碍的肾细胞的损伤进行初步的研究。为探讨孕期缺氧对胎鼠肾脏发育落后的机制，本实验利用大鼠及大鼠肾细胞株（NRK-52E），分别从整体、组织器官、细胞、分子水平，就孕期缺氧诱导的自噬对胎鼠肾脏发育的影响及自噬信号通路进行了研究。第一部分孕期缺氧对胎鼠形态学、血气及肾脏发育和功能的影响目的：观察孕期缺氧对胎鼠形态学的影响，以及对肾脏发育和功能的影响。方法：孕鼠从妊娠第4天至第21天（GestationDay，GD4-21）置缺氧箱（常压低氧，O2浓度为10.5%），建立LBW动物模型。缺氧期间每天称量孕鼠饮食量及体重，计算体重增长量。于GD21天，以剖宫术取胎鼠。以正常胎鼠做对照，测量胎鼠（GD21）的身长、尾长，称量胎鼠体重、脏器如心、肝、肺、肾和脑等重量；用血气分析仪检测胎鼠血气指标；用酶标法分析胎鼠血液中尿酸（UricAcid,UA）、血尿素氮（BloodUreaNitrogen,BUN）、肌酐（Creatinine,CRE）含量；分别对上述样本肾脏组织进行HE染色，光镜观察组织结构；电镜观察胎鼠肾脏的超微结构。结果：与对照组相比，孕期缺氧对孕鼠饮食量有一过性影响、对体重增长量无明显影响，但可显著降低胎鼠的体重、肾量、心重、肝重、肺重及肾重指数、肝重指数；明显降低胎鼠血液中pO2、SO2%水平。组织形态学结果显示孕期缺氧可使胎鼠肾间质增生、肾囊腔增宽、肾小球固缩；足细胞足突分支减少且变低平，线粒体肿胀变形，嵴固缩。结论：孕期缺氧导致胎鼠及肾脏发育落后。第二部分孕期缺氧诱导IUGR胎鼠肾脏自噬及凋亡的机制研究目的：探讨孕期缺氧对胎鼠肾脏自噬及凋亡程度的影响；研究孕期缺氧调控自噬及凋亡的信号通路。分析凋亡及自噬与孕期缺氧诱导的肾发育障碍的相关联系。方法：用放免法检测IUGR胎鼠肾脏组织中可溶性抗凋亡蛋白及自噬相关蛋白；用透射电镜法观察实质细胞中自噬结构的改变；用免疫印迹法检测肾脏组织中凋亡相关蛋白、自噬标记蛋白以及自噬通路、凋亡通路关键蛋白；采用real-timePCR法检测缺氧后肾脏组织LC3mRNA的表达水平。TUNEL染色法检测肾脏细胞发生凋亡的程度。结果：孕期缺氧可导致胎鼠肾脏组织APG5L含量增加，而sFAS无显著变化。孕期缺氧可使肾细胞中自噬小体及自噬溶酶体等自噬结构显著增加，自噬活性增加。与对照组相比，缺氧组自噬相关蛋白LC3-II表达明显增加，而LC3-I表达无明显变化，LC3-II/LC3-I显著增高；p62及BCL-2蛋白表达明显减少。缺氧胎鼠肾脏中的自噬通路关键蛋白Beclin-1,p-S6,HIF-1α表达增加，而AKT及p-AKT含量减少。TUNEL染色阳性细胞缺氧组明显多于对照组。结论：孕期缺氧引起胎鼠肾脏组织中自噬上调及自噬活性增加。激活自噬的机制可能是HIF-1α/BNIP3/Beclin-1通路的激活，而与PI3K/Akt/mTOR通路关系不大。细胞凋亡增加的可能机制是抑制BCL-2信号通路而激活了caspase-3信号途径，与sFas/FasL信号受体途径无关。第三部分低氧对NRK-52E细胞自噬的影响目的：观察低氧对NRK-52E细胞的生长以及自噬程度的影响；探讨自噬在低氧环境下对细胞存亡的影响。方法：首先常规培养NRK-52E细胞，通过倒置显微镜下观察细胞生长及细胞计数，绘制生长曲线图，探索NRK-52E细胞的增殖期，明确NRK-52E细胞进行药物干预的最佳时间；通过western-blot法检测不同浓度3-MA干预后对自噬标记蛋白表达水平影响程度，确定药物干预的最适药物浓度。在最适时机用最佳3-MA药物浓度干预后，用免疫印迹法检测LC3、Beclin1及p62的蛋白表达水平，推测低氧对细胞自噬及其活性的影响；通过MTT法及LDH法分别检测细胞存活率及乳酸脱氢酶漏出率的检测，分析低氧诱导的自噬对细胞存亡的影响。通过使用三气培养箱的使用建立NRK-52E细胞缺氧模型，应用自噬抑制剂，检测自噬表达被抑制时NRK-52E细胞的生长情况；分析在低氧环境中自噬对NRK-52E细胞的存活的作用。结果：在24小时内细胞呈指数形式生长，24小时后进入生长平台期，获得了低氧干预的最佳时间；低氧环境使NRK-52E细胞增殖速度减慢，细胞存活率下降而死亡率上升；同时细胞死亡比率也随缺氧时间的延长而递增；缺氧24h内，细胞数量仍可增加，但其后随缺氧时间延长，细胞数量逐步下降。对低氧的细胞给予3-MA处理后，能明显抑制低氧引起的LC3-II、Beclin1、激活型caspase-3（p20）上调，并维持p62的蛋白表达水平。结论：低氧可使NRK-52E细胞增殖减缓、存活率下降。抑制自噬可减少缺氧引起的细胞死亡（包括凋亡）。
【作者】夏水秀；
【导师】徐智策；
【作者基本信息】苏州大学，胚胎生理与围产基础医学，2014，博士
【关键词】孕期缺氧；胎鼠；肾脏；发育落后；自噬信号通路；蛋白表达；凋亡；NRK-52E；细胞；缺氧；自噬；

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